Подруги уходят; остается одна Марта, кормилица Иоланты. Девушка с большим чувством обращается к ней в своем знаменитом ариозо "Отчего это прежде не знала", в котором задумчиво-созерцательное настроение сменяется страстным порывом.
Из глубины сада доносятся смех и восклицания Бригитты, Лауры и других девушек. Они вбегают, неся корзину, полную цветов. Звучит проникнутый беспечной радостью грациозный хор девушек "Вот тебе лютики, вот васильки". Иоланта хочет, чтобы все подруги были вместе, она дотрагивается до чьей-то руки, думает, что это Бригитта, но на самом деле это Лаура. Иоланта просит Марту спеть ее любимую песню. Ей кажется, что подруги скучают, она взволнована, Бригитта и Лаура ее успокаивают. Марта укладывает Иоланту; одна из прислужниц берет опахало и тихо машет им над головой засыпающей Иоланты. Бригитта и Лаура начинают петь колыбельную песню, затем к ним присоединяются Марта и прислужницы ("Спи, пусть звуки колыбельной навевают сны"). Иоланта уснула. По знаку Марты входят слуги и осторожно уносят заснувшую Иоланту. Бригитта, Лаура, Марта и прислужницы уходят за ней, и песня постепенно замирает.
Вскоре раздается сигнальный звук охотничьего рога и стук в калитку. В сад входит Бертран. Он отворяет калитку. Перед ним Альмерик, он хочет передать приказ короля. Но обычно приказы приносит Рауль, оруженосец, друг Бертрана. Пришелец сообщает, что Рауль накануне умер и он, Альмерик, теперь его заменяет. Бертран скорбит о смерти своего друга. Он принимает от Альмерика письмо, читает его, кланяется новому оруженосцу и впускает его в сад. Альмерик еще и сам не знает, где он оказался. Он сообщает, что вскоре сюда прибудет сам король и вместе с ним знаменитый мавританский врач. И все же, где он находится, кто здесь живет? Бертран объясняет ему, что он у дочери короля Рене слепой Иоланты, невесты Роберта, герцога Бургундии. В разговоре с Альмериком Бертран объясняет суть ситуации с Иолантой: король желает скрыть слепоту Иоланты от герцога Роберта, пока она не исцелится.
Вдали слышны звуки призывного рога - прибыл сам король. Бертран отворяет калитку. Входит король и вместе с ним Эбн-Хакиа, мавританский врач. Эбн-Хакиа пользуется тем, что Иоланта спит, и хочет осмотреть ее в этом состоянии. Марта провожает его к Иоланте. Король пребывает в нетерпеливом ожидании: каков будет вердикт врача? Он поет арию "Ежели роком осужден". Ее суровая, скорбно-патетическая мелодия воплощает душевные страдания отца.
Со ступеней террасы сходит Эбн-Хакиа. Он обращается к королю со словами надежды. Но имеется одно условие исцеления Иоланты - она должна узнать о своем несчастье. Король в ужасе ("И я о мрачной доле убожества ей должен рассказать, раскрыть всю глубину ее несчастья, не ожидая доброго конца?"). И вот врач в своем монологе - арии "Два мира", написанной с явно выраженным восточным колоритом, - формулирует философско-этическую концепцию прозрения:

Два мира - плотский и духовный-
Во всех явленьях бытия
Нами разлучены условно,
Они едины, знаю я.
На свете нету впечатленья,
Что тело знало бы одно,
Как все в природе, чувство зренья
Не только в нем заключено.
И прежде чем открыть для света
Мирские, смертные глаза,
Нам нужно, чтобы чувство это
Познать сумела и душа.
Да, тогда возможно, что желанье
Пробудит свет в ее очах.

Ответа короля Эбн-Хакиа готов ждать до вечера этого дня. Он уходит. Но король полон решимости не раскрывать Иоланте тайну ее недуга ("Вход сюда ценою жизни купит, кто пожелает тайну ей открыть"). Король уходит.
Сад некоторое время пуст, затем у калитки раздаются голоса Роберта и Водемона, сбившихся с пути двух рыцарей. Еще в детстве Роберт был обручен с Иолантой, но никогда ее не видел и не знал, что она слепа. Теперь, когда он стал взрослым, все его помыслы направлены к графине Лотарингии Матильде, и он едет к королю Рене, чтобы просить его о расторжении помолвки с Иолантой. Так они оказались у этой калитки, которую открывают, и входят (они и не подозревают, что уже оказались во владениях короля Рене). Рыцари видят запрещающую надпись и недоумевают, почему "сюда нельзя войти под страхом смертной казни". Но их не страшит угроза смерти, и они направляются в глубь сада, рассуждая по дороге о том, кем могла бы оказаться Иоланта. "А вдруг она прелестна?" - задается вопросом Водемон. "Наверно, чопорна, горда..." - предполагает Роберт, и поскольку мечтает лишь о Матильде, то поет здесь свою знаменитую арию "Кто может сравниться с Матильдой моей".
Так они разговаривают между собой, но в какой-то момент задаются все же вопросом: "Где же мы?" Все окружающее представляется им истинным раем. Они замечают "следы прелестной ножки... они ведут к террасе..." Водемон поднимается на террасу (дверь оказывается открытой), и его взору предстает спящая Иоланта. Он поражен ее красотой и не может подавить возглас восхищения. Иоланта просыпается. Водемон сбегает с террасы и сообщает Роберту, что Иоланта проснулась и идет сюда. Роберт старается силой увести Водемона. Тот вырывается. Иоланта слышит незнакомые голоса, она спрашивает незнакомцев, кто они. Роберт просит Водемона не открываться и не называть их имен. Водемон, однако, представляется и говорит, что они заблудились. Иоланта приветливо встречает их, она хочет напоить их вином и идет за ним. Роберт опасается, что это западня, что им грозит гибель. Он уходит.
Наступает центральный эпизод оперы - встреча Водемона и Иоланты. Иоланта возвращается с двумя кубками вина. Водемон берет один кубок и пристально смотрит на Иоланту - он не исключает мысли о возможном отравлении, но из этих рук с отрадой готов принять смерть. Иоланта продолжает держать поднос со вторым кубком, ожидая, что его возьмет Роберт. На ее вопрос, где же Роберт, Водемон отвечает, что он ушел. Иоланта сожалеет: она "рада всем, кто здесь бывает". Водемон восхищен красотой Иоланты и признается, что видит, что она слепа. Иоланта необычайно взволнована, она подходит к кусту роз и срывает в замешательстве цветы. Ей, признается она, его слова слушать странно и приятно. Водемон просит сорвать ему красную розу. Иоланта срывает цветок и подает ему. Но это оказывается белая роза. Он снова просит красную, и Иоланта снова срывает белую. Водемон говорит ей об этом, но Иоланта ничего не может понять. Что значит "красную?" - недоумевает она. Водемон начинает догадываться, в чем дело. Он срывает несколько роз и настойчиво спрашивает, сколько их у него. Она просит их потрогать (чтобы сосчитать). Он отступает. Теперь ему совершенно ясно: Иоланта слепая. Охваченный состраданием, он рассказывает ей о том, как прекрасен свет, вечный источник радости и счастья ("Чудный дар природы вечной"). Иоланта в упоении, Иоланта внимает словам Водемона.
Появляется король. Иоланта идет ему навстречу и обнимает его. Выходят Эбн-Хакиа, Бертран и Альмерик. Король гневно обращается к Водемону: кто он и как вошел сюда? Он отвечает, как все было. В разговор вступает Иоланта, и становится ясно, что теперь она знает о своей слепоте. Король в отчаянии. Его успокаивает Эбн-Хакиа:

Сознанье в ней теперь проснулось,
Открылась истина уму!
Питай надежду,
Что в ней желанье пробудит свет!
Теперь возможно, что желанье
Даст ей свет!

Звучит большой ансамблевый номер, в котором вместе с Эбн-Хакиа поют Иоланта (в восторге от открывшейся ей истины), Водемон (в отчаянии от открытой Иоланте истины), Бертран, Марта, Альмерик, Лаура и Бригитта (в гневе на незнакомца за его дерзость и нарушение приказа короля).
Теперь король угрожает (притворно) Водемону смертной казнью. Иоланта в отчаянии и призывает врача, чтобы он сказал ей, что она должна претерпеть, чтобы спасти Водемона.
Тот говорит ей, что она должна всего лишь "пламенно желать увидеть свет". Иоланта горячо и страстно поет свою арию "О, чтоб его спасти, Безропотно могу я все снести". Водемон покорен Иолантой, он падает перед ней на колени {"Ангел светлый! дорогая, Пред тобой склоняюсь я!"). Он готов за нее умереть. "Нет, - восклицает Иоланта. - Живи!.. Я буду видеть" (король ведь пригрозил, что жизнь или смерть Водемона будет зависеть от того, исцелится ли Иоланта).
Иоланта уходит. Король обращается к Водемону и признается ему в том, что он не взаправду угрожал ему, - он хотел лишь возбудить в дочери острое желание прозреть. Теперь время им обоим узнать, кто есть каждый из них. Водемон представляется - он Готфрид Водемон, граф Иссодюна, Шампани, Клерво и Монтаржи. И он просит руки Иоланты. Но король вынужден отказать, ведь дочь уже давно помолвлена с другим. Король не успевает договорить, слышится шум. Это сюда является Роберт, герцог Бургундский, с оруженосцами. Увидев короля Рене, он преклоняет перед ним колена. На сей раз поражен Водемон. Теперь все выясняется: Роберт просит короля о расторжении своей помолвки с Иолантой, поскольку его сердце отдано Матильде.
Король теперь без угрызений совести отдает дочь Водемону. И вот входит Бертран с долгожданной вестью: "Свершилось!" Иоланта видит! Эбн-Хакиа вводит Иоланту. Она в повязке. По знаку врача все отступают в глубину сада. Становится совсем темно; только дальние вершины гор чуть освещены отблеском вечерней зари. На небе появляются звезды. Эбн-Хакиа снимает повязку с глаз Иоланты. Иоланта поначалу испугана, она не узнает своего сада.
"Смотри наверх, Тебя не испугает небо", - говорит ей врач. Иоланта приходит в восторг от вида звездного неба, она опускается на колени. Ее взору постепенно открывается окружающий мир, она видит отца, узнает подруг и Водемона, который отныне будет ее защитником. Все славят свет, источник жизни. Все опускаются на колени.